否！滾去學習！

今天小達君就帶大家學習一波sao酷炫操作：同時獲得單細胞mRNA和表面抗原信息。絕對是熬夜也要學會的新技能哦～

我們先來看看單細胞測序（Single-cell sequencing）

普通測序所提取的RNA（或DNA）源于樣本中的多個細胞，得到的RNA信息是混雜在一起的，所以沒辦法鑒別不同細胞間存在的異質性（Heterogeneity），而很多發育過程或者疾病發生等往往是與一些特定細胞的作用有關，這個時候普通測序就不能研究這些特定的單個細胞發揮的巨大作用；而單細胞測序則是針對單個細胞的基因組進行測序，能夠更好地幫助我們認識細胞與細胞之間的差異。單細胞測序技術自2009年問世，2013年被Nature Methods評為年度技術以來，越來越多地被應用在科研領域：腫瘤異質性研究、個體發育、干細胞研究、新細胞與稀有細胞亞型的鑒定等。

新冠肺炎爆發至今，已經有多篇單細胞測序助力新冠肺炎致病機理研究和治療方案探索的文章。同濟大學左為團隊利用單細胞測序技術對人體肺臟內每一個細胞的表達情況進行了分析，研究表明，ACE2受體的表達主要集中在肺內一小群II型肺泡上皮細胞(AT2)上¹；浙江大學鄭敏團隊等也利用單細胞測序技術分析了呼吸道不同位置組織中的ACE2 RNA表達譜，結果表明ACE2在鼻上皮細胞中也表達，說明鼻腔也可能是病毒感染侵襲的重要器官²。

在新冠治療方案探索中，單細胞測序也貢獻了巨大的力量：北京大學BIOPIC/ICG等單位用高通量單細胞測序分析新冠病毒康復者體內B細胞VDJ基因重排生成的抗體，找到了新冠肺炎多種全人源抗體³; 然后是上海大學等單位的研究表明MSCs移植治療新冠肺炎具有安全性和有效性，能夠緩解病人癥狀，改善肺部炎癥。同時他們利用10X單細胞測序技術對移植的MSCs進行單細胞測序分析，發現MSCs呈ACE2或TMPRSS2陰性，不被COVID-19感染；MSCs高表達抗炎因子和營養因子，進一步證實MSCs的免疫調節功能；MSCs高表達SPA和SPC，提示MSCs極有可能分化成肺部AT2細胞；MSCs表達抗病毒通路的基因⁴。

以上提到的例子只是單細胞測序展現的迷人一角，別著急，小達君還有洪荒之力沒有使出來呢：同時獲得單細胞mRNA和表面抗原信息

隨著單細胞RNA測序的發展，單純的 mRNA 的信息對研究人員來說已經不能滿足他們的需求，在2017年 Peterson,et. al ⁵ 及 Stoeckius, et. al ⁶  通過偶聯在抗體上的 oligo 序列（標簽抗體），獨創性地利用 10X Genomics 平臺獲取細胞表面抗原的信息，并且是真正意義上的獲取了同一個細胞的 mRNA 和蛋白信息。2019年，Nature Method將單細胞多模態組學（Single Cell Multimodal Omics）評選為年度技術，同時獲得單細胞mRNA和表面抗原信息也是單細胞多模態組學的一種， 1+1>2 是這項技術最迷人的地方。

Biolegend利用這項技術研發的抗體上連接的這段oligo由3部分組成，第一部分是一段PCR handle序列，它是匹配二代測序平臺的擴增模板；第二部分是一段Antibody Barcode，一段15nt的特異性序列，唯一barcode和唯一抗體克隆號對應；第三部分是捕獲序列，與GEL beads或capture beads上的oligo序列互補配對，使得抗體上的oligo可以被beads所捕獲。而TotalSeq?-A設計用于依賴poly-dT作為mRNA捕獲的方法的單細胞測序平臺，如10X Genomics；TotalSeq?-B是與10X Genomics公司最新Single Cell Gene Expression (3’ v3)相兼容，而TotalSeq?-C抗體是與10X Genomics公司的Single Cell ImmuneProfiling (5’)相兼容。

小達君感覺大家被這個超大的招砸的有點懵。來來來，小板凳準備好，小達君給大家扒一扒這種同時獲得單細胞mRNA和表面抗原信息的新技術到底有哪些優勢：

在單細胞RNA測序中，盡管有的細胞表達了相應的mRNA，但是無法被單細胞mRNA測序所檢測到，但是假如加上標簽抗體之后，可以識別細胞表面的蛋白，改善dropout現象⁶。

僅僅通過mRNA的數據將PBMC細胞進行聚類分析，發現其中某些轉錄本相似的群體之間，難以區分（圖A）；加上抗體標簽的信息之后，CD4⁺細胞和CD8⁺細胞之間的分群得到改善。并且CD4細胞亞群之間的區分度更高（圖B）。

常規的多色流式細胞術，可以同時檢測20+抗體，它的發展受限于不同熒光素之間的補償；較新的技術，比如光譜流式及質譜流式，通過全光譜解析或者金屬離子偶聯代替熒光基團，可以同時檢測細胞上30+甚至40+的指標，但是他們也受限于熒光素和金屬離子的種類；但是TotalSeq?的抗體就不一樣了， 由15個堿基組成的Antibody Barcode理論上的組合數遠大于現有抗體的數。Stoeckius et al 在文章中使用了14個抗體的組合，Peterson et al在文章中使用了82個抗體，BioLegend在廠內做了單個細胞上220個抗體的組合實驗！現在限制單細胞表面抗原檢測的不再是熒光素的種類，而是現有抗體的種類！

TotalSeq?  Human TBNK Cocktail是BioLegend專門為單細胞測序設計的panel。這些凍干的抗體方便使用，且已經根據人PBMC預先優化并滴定濃度，并且按照1test/支進行包裝，可以直接使用。

精彩回顧

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參考文獻

1. Yu Zhao, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCoV.BioRxiv.Jan.26,2020.

2. Chao Wu et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCoV, in the nasal tissue. medRxiv 2020.02.11.20022228.

3. https://biopic.pku.edu.cn/zxdt/501497.htm

4. Zikuan Leng, et al. Transplantation of ACE2- Mesenchymal Stem Cells Improves the Outcome of Patients with COVID-19 Pneumonia. Aging and disease, DOI: 10.14336/AD.2020.0228

5. Peterson VM, et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nat Biotechnol. 2017;35(10):936-939

6. Stoeckius M, et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 2017;14(9):865-868