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凝膠電泳和染色方法應該如何選擇？

作者：admin 信息來源：達科為日期：2021年08月13日打印字體：大中小

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凝膠電泳是生命科學研究中常規使用的分離和分析帶電大分子的核心分子技術。可以根據蛋白質和核酸片段的大小、電荷或構象分離和純化大分子。盡管凝膠電泳方法通常作為隨后PCR的分析方法進行，但在印跡、克隆、DNA測序和其他各種下游應用之前，作為制備技術也有很多成功的案例。

凝膠盒是裝滿緩沖液的容器，一端為陰極（負極），另一端為陽極（正極），并配有外部電源。凝膠既是反對流介質，也是篩分介質，首先將凝膠浸沒在緩沖液中，其孔靠近陽極。然后使用移液器，將樣品上樣至凝膠孔中。當打開外部電源時，向緩沖液施加電場，使帶電分子通過凝膠向相反末端（即朝向陽極）移動。根據分子的大小，它將以不同的速率和距離通過基質。較小的分子將比較大的分子更快地通過凝膠基質遷移，最小的分子移動最遠。

一、凝膠電泳的類型

兩種最常見的凝膠電泳方法包括用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳和用于分離蛋白質、500個堿基對或更少的核酸片段的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，下表總結了瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳之間的關鍵差異。

二、分離后DNA樣品的可視化

通過電泳分離后，可以使用幾種不同的方法顯示核酸片段。最廣為人知的核酸片段可視化方法是用溴化乙錠(EtBr)染色。但是， EtBr具有高度致癌性、細胞毒性和致突變性且其對環境有害，必須謹慎使用和處理。EtBr的更安全替代品包括新型凝膠染色劑，如Gelite?Safe 10,000X水溶液、Gelite? Safe 10,000X DMSO溶液，以及凝膠染色試劑盒，這些凝膠染色劑和試劑盒不僅致突變性低于EtBr，而且Gelite?Safe可以檢測瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸，靈敏度更高，背景干擾更小。

Gelite? Safe-更靈敏和更穩健的DNA凝膠染色液

Gelite?Safe是一種極其靈敏和穩定的熒光染料，用于電泳凝膠中DNA的可視化。與高毒性EtBr不同，Gelite? Safe危害更小、無細胞毒性和無致突變性，并且與EtBr和SYBR?Safe相比其靈敏度更高、背景熒光更低。Gelite? Safe強大的DNA結合親和力允許DNA在電泳前或電泳后染色而不脫色，并且由于Gelite?Safe對DNA具有特異性，即使樣品中存在RNA也不會出現非特異性結果。Gelite? Safe在280nm和513nm處具有最大熒光激發波長，并且在552nm處具有最大熒光發射圖譜。這些獨特的光譜特性拓寬了Gelite? Safe的儀器兼容性，包括UV和藍光透射儀、凝膠記錄系統和激光掃描儀，并且其單一配方，允許使用綠色或紅色通道進行檢測。

圖1.在TBE緩沖液的1%瓊脂糖凝膠，使用Gelite?Safe、EtBr和SYBR?Safe檢測DNA的比較。從左到右以100ng、50ng和25ng的量上樣1kb DNA Ladder,根據生產商推薦的濃度，用Gelite?Safe、EtBr和SYBR?Safe對凝膠染色60min，并使用ChemiDoc?成像系統(Bio-Rad?)，配備GelGreen濾光片的300nm透射儀對凝膠進行成像。

Gelite? Safe使用方法—適用于“膠染”和“泡染”兩種方法

1. 工作溶液的制備

用您選擇的pH范圍為7.5-8.5的緩沖液（例如，TAE、TBE或TE，首選pH8.2）稀釋10,000X儲存溶液，制備1X Gelite?安全工作溶液。

注：在水中制備的染色溶液的穩定性低于在緩沖液中制備的溶液，必須在24小時內使用，以確保最大的染色靈敏度。

2. 染色方法

膠染

a.使用標準方案制備瓊脂糖凝膠溶液。

b.在傾倒凝膠之前，將10,000XGelite?Safe儲備試劑以1:10,000稀釋到凝膠溶液中，并充分混合。

c.根據您的標準方案進行凝膠電泳。

泡染

a.根據您的標準方案進行凝膠電泳。

b.將凝膠置于適當的聚丙烯容器中。輕輕加入足量的1X染色溶液浸沒凝膠。

注：不要使用玻璃容器，因為它會吸附染色液中的大部分染料。

c.在室溫下輕輕震蕩凝膠約30-60min。避光保存染色容器。

注：無需脫色。無需任何清洗步驟即可采集圖像。

三、分離后蛋白樣品的可視化

對于蛋白質，可以使用顯色化學反應或染料結合方法實現可視化。確定使用哪種方法在很大程度上取決于實驗條件和預期的下游應用。檢測凝膠中蛋白質的常用策略包括考馬斯亮藍染色、銀染、鋅染和熒光染料染色。雖然考馬斯亮藍染料和銀染方法在總蛋白譜分析中仍然非常流行，但熒光染料染色方法提供了更高的靈敏度和線性動態范圍。

BioSci? SpectBlue Protein Staining Reagent-考馬斯亮藍替代快速染液

一款快速、高靈敏、低背景、低毒的考馬斯亮藍替代液。本產品不含甲醇、乙酸及三氯乙酸，配方環保，無刺激性氣味，脫色時不需要使用有害溶劑。可用于SDS-PAGE 膠中蛋白質的快速染色，無需有毒的脫色液處理。本產品靈敏度高，最少只需15 分鐘即可觀察到10 ng 的蛋白條帶，適當延長染色時間可進一步提高靈敏度。染色結束后可立即觀察到清晰的蛋白條帶，使用純水脫色可進一步降低背景，提高信噪比。

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